水产养殖户弧菌实用检测方法及实验器材试剂

水产养殖户弧菌实用检测方法及实验器材试剂

一、弧菌检测器材和试剂 (水产养殖户简易实验室用）
电炉一台、天平（0.1克）1台、一次性无菌培养皿（90mm）10个、100ml量筒1个、三角烧瓶500ml1个、500ml烧杯1个、无菌巴氏滴管若干 支 或移液枪一支（配套无菌吸头）
酒精灯1个、酒精1瓶、三角涂布棒1个或无菌L型涂布棒、玻璃棒1支 、TCBS培养基1瓶、无菌采样瓶若干（按采样数）、接种环 1支 或一次性无菌接种环、小型恒温培养箱  1台
 
二、样品采集

1、用无菌采样瓶采集水下约20cm处水样，采好的水样需盖紧瓶。
2、采得的水样立即送检，否则，应将样品置于冰瓶或冰箱中，但也不得超过24h，否则将影响检验结果。  
 
三、检验步骤
1、培养基称量煮沸倒平板  
1） 称量8.91克TCBS琼脂粉（可按比例增减）和100ml蒸馏水或纯净水（没有条件的用冷却开水或桶装水），倒入洗净的三角烧杯中，加热搅拌，溶解琼脂粉，直至沸腾。
培养基溶解判定标准：轻摇三角瓶，挂在瓶壁上的液体里没有颗粒，即为全部溶解。难溶解的颗粒为琼脂，颗粒溶解不充分的话，制作的培养平板易破，不耐用。

 
2）在灭菌操作台上，将沸腾后的培养基冷却到50~60℃，分别倒入一次性无菌培养皿中，每个培养皿约15~20mL，待其冷却凝固，倒置于超净工作台或无菌泡沫箱内保存备用。
注意：倒好的平板内不能有水珠或水层。 ，如平板表面有水珠，可放在25 ℃～50 ℃的培养箱里干燥，直到平板表面的水珠消失。

 
2、菌液接种   
在灭菌操作台上，用无菌巴氏滴管或（无菌枪头）取水样（可稀释）0.05mL（2~3ml无菌巴氏滴管一滴约50微升），滴入制好的培养皿培养基上，用灭菌的三角涂布棒将菌液涂抹均匀，平放于操作台上数分钟，使菌液渗入培养基。 （没有超净工作台的，应选相对洁净的环境，现用现配，在火焰旁操作。塑料无菌涂布棒不能靠近酒精灯。）

 
3、弧菌培养  
将接种培养皿倒置恒温培养箱箱内培养，于36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h左右，取出计数菌落。在通常情况下，涂布后，将平板静置 10 min，如样液不易吸收，可将平板放在培养箱 36 ℃±1℃培养1 h；等样品匀液吸收后翻转平皿，倒置于培养箱，
 
如不是在恒温培养箱用37℃培养，在室温环境培养，由于室温温差的原因会严重影响弧菌菌落形成的数量和时间。
 
4、菌落计数  
分别点数绿色菌落和黄色菌落数量，乘取水样的稀释倍数，即可得该水样的绿色和黄色弧菌总数。
典型的副溶血性弧菌在TCBS 上呈圆形、半透明、表面光滑的绿色菌落，用接种环轻触，有类似口香糖的质感，直径2 mm～3 mm。
注意：选用TCBS作为分离培养各种弧菌的培养基，特异性不是很强；不少细菌在TCBS上也能生长，但生长较慢，需要培养24h后方可长成0.5~1mm的黄、绿色菌落。为有效排除干扰，及时准确地判断出是否存在弧菌属细菌，可结合弧菌属细菌在TCBS培养基上生长的特点：弧菌生长快，菌落大，培养4-5h原划线处有菌苔生长，8-10h可长出小菌落，16h菌落可达2mm;其他菌在TCBS上则无此特点。因此在筛选弧菌属细菌的选择性培养基时要特别注意在确定的培养时间内进行菌落的观察，时间超过即影响其准确性。

部分弧菌在TCBS培养基上的颜色见：http://www.xmmc17.com/anquan/357.html

 
5、废物处理  
经计数后不用的培养基，需经灭菌煮溶后，方可到人排水沟。
经常性检测虾塘水体的弧菌密度。要求总弧菌的密度控制在5000菌株/毫升以下，绿弧菌的密度控制在300菌株/毫升以下。
底泥中弧菌数量远超水体中弧菌数量，有时水体无法检测出弧菌，底泥中却依旧含有相当多的弧菌。东山地区建议增加底泥样品弧菌检测。

以上图片来源网络。
养殖户简单地检测弧菌，需要的最简单的弧菌检测仪器和设备
   

名称	规格型号	数量	估价（单价）
万用电炉	泰斯特DK-98-II单联	1台	98.00
天平	0.1g, YP2001B	1台	260.00 (不同厂家型号价格不同）
小型恒温培养箱	25*25*25cm 镀锌铁内胆	1台	900.00 （另有不锈钢内胆材质）
一次性无菌培养皿	90mm，10个/包，500个/箱	1箱	整箱400元，拆零10元/包
100ml量筒	100ml  亚速旺	1支	28.00
三角烧瓶	500ml  蜀牛	1个	16.00
烧杯	500ml  亚速旺	1个	12.00
无菌巴氏滴管	独立包装  每滴约50微升。	20支	100支以下0.8元/支
酒精灯	酒精需要另外购买	1个	8元
玻璃搅拌棒		2支	3元/支
玻璃涂布棒		若干	3元/支
一次性无菌L型涂布棒	10支/包	20支	8元/包  （独立包装的1元/支）
一次性无菌接种环	一次性使用	5支	1元/支
优质接种环+接种棒	接种环可使用上千次。	1支	50元
TCBS培养基	陆桥  250克/瓶	1瓶	130元/瓶
无菌采样瓶	100ml ，按采样数	若干	3元/个
可灭菌采样瓶60ml	PP材质，可高压灭菌	若干	4.8元/个

 
不同厂家仪器价格不同，另外距离远近运费也不同，以上价格为估价，实际以正式报价为准。
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