铜绿假单胞菌检测方法及铜绿假单胞菌快速检测试剂（酶底物法）

江苏省理化测试中心马慧娟、徐慧、高宏 食品安全导刊中提到铜绿假单胞菌检测技术包括膜过滤法、荧光定量PCR法、LAMP法、酶底物法。　　
       国标滤膜法
　　检测桶装水中铜绿假单胞菌的方法是GB 8538-2016《食品安全国家标准 饮用天然矿泉水检验方法》。铜绿假单胞菌产色素分为三种：产绿脓菌素，产青脓素，产红脓素；铜绿假单胞菌在4℃不生长而在42℃可以生长；具有氧化酶，可以使细胞色素C氧化，再由氧化型细胞色素C使对苯二胺氧化，生成有色的醌类化合物：可以产生一种脱酰胺酶，可使乙酰胺经脱酰胺作用释放氨，滴加纳氏试剂（碘化汞钾），氨在碱性条件下与碘化汞钾作用，生成红色络合物；根据这些生化特性，通过滤膜过滤将铜绿假单胞菌富集到CN琼脂上，再用生化试剂管进行生化鉴定。也可以用VITEK 2 Compact 全自动细菌鉴定系统用于微生物鉴定，准确率高，可用于微生物实验室的日常检测工作。
　　
　　实时荧光定量PCR检测
　　外毒素 A 基因在铜绿假单胞菌中高度保守，根据铜绿假单胞菌外毒素A基因片段序列，设计特异性引物及TaqMan探针，并利用实时荧光 PCR技术，对目标靶序列进行特异性扩增，建立了一套检测食品中铜绿假单胞菌的方法，特异性试验和灵敏性试验良好，该检测方法具有特异、快速的特点，能够满足检测要求，为食品中铜绿假单胞菌的快速检测奠定了基础。
　　
　　LAMP检测
　　环介导等温扩增技术（以下简称LAMP）：利用链置换DNA聚合酶在等温条件下进行反应，40min内可完成核酸扩增，检测过程不需要昂贵的仪器设备，简单的水浴锅即可，扩增产物不需要繁琐的电泳过程，快速灵敏，特异性强，成本低，尤其适合大量、即时、现场的病原微生物的初筛，易于在基层推广应用。
　　
　    铜绿假单胞菌快速检测试剂（酶底物法）
酶底物法（Pseudalert）采用特异性固定底物技术，目标细菌产生能够分解 Pseudalert 底物特定的酶，产生荧光，在24 h内即可得到结果，无需进行验证试验，该方法能够较好地弥补传统滤膜法在检测工作中的不足，在美国和欧洲部分地区已经被批准为检验铜绿假单胞菌的标准方法。
其中，酶底物法已经应用在GB5749-2006,生活饮用水标准和环境标准《HJ 1001-2018 水质 总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌的测定 酶底物法》中。
        含菌量少的样品需要先浓缩
         浓缩后定性检测：取250ml包装饮用水样品，用不锈钢过滤系统及无菌滤膜过滤，无菌操作取出滤膜，剪碎后放于无菌试管中，再加无菌水3毫升，放振荡器中振荡30-60秒。
吸取上清液转移至100ml样品瓶中，再加无菌水至100ml,再加入铜绿假单胞菌酶底物试剂，溶解后放入36℃培养箱中培养24小时。
        含菌量大的样品可直接用无菌瓶取样100ml,再加入铜绿假单胞菌酶底物试剂，溶解后放入36℃培养箱中培养24小时。
培养24小时后，在360nm紫外灯下观察结果，蓝色荧光表明存在铜绿假单胞菌。
       铜绿假单胞菌快速检测试剂（酶底物法）定量检测：如需定量检测，可用定量盘配合程控封口机，根据定量盘上阳性样本数查表格。
 
       实时荧光定量PCR检测缺点：对仪器人员要求高，设备昂贵。对死菌不易鉴别，容易假阳性。
      LAMP法检测缺点：需要离心机、恒温金属浴等设备，阳性对照容易污染实验室引起假阳性。
       酶底物法特点：定性检测无需特别人员，设备，只需要360nm紫外灯,紫外防护眼镜、小型恒温培养箱，大大减少饮用水厂人员设备投入。但如需定量检测，需要程控封口机及定量盘，投入成本较高。
                       铜绿假单胞菌快速检测试剂酶底物法配套产品：

铜绿假单胞菌酶底物法试剂	定性或者定量
100ml无菌瓶	含硫代硫酸钠/不含硫代硫酸钠
360nm紫外灯	荧光反应
紫外防护眼镜	防止紫外线对眼睛伤害
小型恒温培养箱	36℃-38℃
三联不锈钢过滤系统	膜过滤，浓缩
无菌滤膜	200张/盒 0.45μm
漩涡振荡器	试管振荡
程控封口机/定量盘	铜绿假单胞菌快速检测试剂酶底物法（定量）

 
 
厦门敏测实验器材公司即将推出铜绿假单胞菌快速检测试剂盒（酶底物法）。敬请期待！